Одри родилась 4 мая 1929 г. в Брюсселе. Она была единственным ребенком Джона Виктора Растона  и баронессы Эллы Ван Хеемстра, голландской аристократки, в роду которой были французские дворяне и английские монархи (в частности, король Эдуард III).

Хепберн училась в частных школах  Англии и Нидерландов. Её мать была строгой женщиной, отец был более добродушным, поэтому девочка предпочитала его. Он оставил семью, когда Одри была ещё ребенком. Позже она назовет его уход самым болезненным моментом в своей жизни. Много лет спустя с помощью Красного Креста она отыскала своего отца в Дублине и поддерживала его материально вплоть до его смерти.

Свои школьные годы Одри провела в оккупированном фашистами Арнхеме (Голландия), где она жила с матерью после развода родителей. Одри училась балету в Арнхемской консерватории, но когда Нидерланды были захвачены фашистами, занятия пришлось прекратить. Как многие подростки, Одри стала помогать движению Сопротивления, но в конце войны тяжело заболела и снова стала на ноги только в первые дни мира.
После войны Одри продолжила образование в Лондоне. В начале 50-х годов Одри посещала классы актерского мастерства Феликса Эйлмера и снималась в нескольких британских фильмах.

В 1951 году французская писательница Колетт, увидев Одри на съемках картины «Малышка из Монте-Карло», настояла на том, чтобы Одри исполнила главную роль в бродвейской постановке ее романа «Жижи». Благодаря этой весьма успешной работе, Хепберн вскоре сумела получить роль в фильме «Римские каникулы» с Грегори Пеком, за которую была награждена премией «Оскар» как лучшая актриса. Впоследствии она еще четырежды номинировалась на «Оскар».

В 1954 году Одри знакомится с дизайнером Юбером де Живанши и становится его музой и подругой.После «Римских каникул» Хепберн снималась в фильме «Сабрина» с Хамфри Богартом и Уильямом Холденом, с которым у нее даже завязался роман и за которого она мечтала выйти замуж.Созданное дизайнером для фильма "Сабрина" маленькое черное платье на бретельках пережило с тех пор неоднократное возрождение.

В 1954 году Одри вернулась на театральную сцену в роли русалки в пьесе «Ундина», где её партнером был Мэл Феррер, за которого она в этом же году вышла замуж. За свою роль в «Ундине» Хепберн получила премию «Тони» за лучшую женскую роль в 1954 году. Эта премия, полученная всего лишь через шесть недель после «Оскара», упрочила её репутацию актрисы, как кино, так и театра. К середине 50-х Хепберн также стала признанной законодательницей мод. Её внешность в стиле gamine и широко признанное чувство шика имели массу поклонников и подражателей. Одри не могла не вызывать восхищение, она была воплощением благородной элегантности и изящества, у нее был дар преподносить даже самую простую одежду как рафинированное и утонченное творение моды. Практически ни один модный сезон не обходится без классической детали стиля Одри (юбки-колокольчики, солнцезащитные очки на пол-лица, диадемы, ярко-подведенные брови, леггинсы с туфлями-балетками, короткая челка и пр.).

В 1960 году у Хепберн родился сын Шон от брака с Мэлом Феррером.Роль Холли Гоулайтли, сыгранная Хепберн в фильме «Завтрак у Тиффани» 1961 года, превратилась в один из самых культовых образов американского кино XX века. Хепберн назвала эту роль «самой джазовой в своей карьере». Когда её спросили, в чём заключалась сложность этой роли, Хепберн сказала: «Я интроверт. Играть девушку-экстраверта оказалось самой сложной вещью, которую я когда-либо делала». На съёмках она носила очень стильную одежду (в том числе знаменитое «маленькое чёрное платье», ставшее после выхода фильма на экраны настоящим хитом), созданную ею в соавторстве с Живанши, и добавила высветленные пряди к своим каштановым волосам. Найденный таким образом стиль она сохранила и вне съёмок. Дружбу с Живанши актриса пронесла через всю жизнь, став его постоянной клиенткой. Свои первые духи L`Interdit Юбер посвятил именно Одри.

Одри Хепберн снималась в 1964 году в мюзикле «Моя прекрасная леди», появления которого ждали с нетерпением достойным «Унесённых ветром». Хепберн была выбрана на роль Элизы Дулиттл вместо Джулии Эндрюс, которая уже играла эту роль на Бродвее. Решение не приглашать Эндрюс было принято ещё до того, как Хепберн была утверждена на роль. Изначально Хепберн отклонила предложение и попросила Джека Уорнера отдать роль Эндрюс, но когда ей сообщили, что снимать будут либо её, либо Элизабет Тейлор, она согласилась. По словам статьи в Soundstage magazine, «все согласились, что если Джулии Эндрюс не будет в фильме, Одри Хепберн является отличным выбором». Кстати, Джулия Эндрюс должна была играть в «Мери Поппинс», фильме, который выходил в том же году, что и «Моя прекрасная леди».

С 1967 года после пятнадцати весьма успешных лет в кинематографе, Хепберн снималась от случая к случаю. После развода со своим первым мужем Мелом Феррером он вышла замуж за итальянского психиатра Андреа Дотти, родила второго сына Люка и переехала в Италию. Беременность протекала тяжело и потребовала почти постоянного соблюдения постельного режима. В начале 70-х годов в Италии возросла активность террористов «Красной Армии», и Одри разводится с Дотти и пытается вернуться в кино, снявшись с Шоном Коннери в фильме «Робин и Мариан» в 1976 году. Фильм получил умеренное признание, далекое от обычных высоких оценок фильмов с участием Хепберн. К удивлению окружающих, Одри отвергла казавшуюся явно написанной под неё роль бывшей балерины в The Turning Point (данную роль получила Ширли Мак Лейн, и успешный фильм упрочил её карьеру). Хепберн позднее сказала, что больше всего она сожалеет о том, что отвергла эту роль.

В 1979 году Хепберн предприняла ещё одну попытку вернуться, снявшись в «Кровных узах». Книги Шелдона были столь популярны, что его имя было включено в название фильма, и это, очевидно, заставляло Хепберн считать, что фильм обречен на успех. К сожалению, это было не так. Критики, даже те из них, которые сами были поклонниками Хепберн, не могли рекомендовать фильм, ввиду явной банальности материала.

Последняя главная роль Хепберн в кино была в паре с её новым увлечением Беном Гадзара в современной комедии «Они все смеялись», небольшой, стильной и светлой картине — настоящем номере под занавес для Хепберн, — снятой Питером Богдановичем. Фильм пользовался успехом у критики, но был омрачён жестоким убийством одной из его звезд — подруги Богдановича Дороти Страттен. В 1987 году Хепберн снималась с Робертом Вагнером в ироническом детективном телефильме «Любовь среди воров», который заимствовал элементы из некоторых её знаменитых фильмов, в частности из «Шарады» и «Как украсть миллион». Фильм пользовался умеренным успехом, причем Хепберн сами говорила, что приняла в нём участие ради развлечения.

Последняя роль Хепберн в кино, (так называемая камео) была роль ангела в фильме Стивена Спилберга «Всегда», снятом в 1989 году.

Вскоре после её последнего появления в кино Хепберн была назначена специальным послом ЮНИСЕФ. Испытывая благодарность за собственное спасение в период после нацистской оккупации, она посвятила остаток своих дней улучшению судьбы детей, проживающих в беднейших странах мира. Работа Хепберн сильно облегчалась благодаря знанию целого ряда языков. Она разговаривала на французском, английском, испанском, итальянском и голландском языках. Она выучила итальянский, когда жила в Риме. Испанский она выучила самостоятельно, и существует съёмка ЮНИСЕФ, на которой Хепберн бегло говорит на испанском с жителями Мехико. Во время поездки в Сомали у неё начались невыносимые боли в желудке. Одри никому ничего не сказала, чтобы сопровождающие не надумали тут же свернуть программу поездки. К врачу она обратилась, лишь вернувшись из Африки. Врач констатировал рак. Одри Хепберн скончалась 20 января 1993 года в маленьком швейцарском городке Толошеназе недалеко от Лозанны.